分光光度计的原理和分类

一.分光光度计的一般原理：

分光光度计是利用分光光度法，通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析。

不同种类的分光光度计的基本原理相似，都是利用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源。光源透过测试的样品后，部分光源被吸收，通过测量样品的吸光值，经过计算可以转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。

二.分光光度计有哪些不同的类型，不同种类的应用领域的区别：

分光光度计有哪几种不同的分类方式：

1.分光光度计按照波长及应用领域的不同可以分为：

(1)可见光分光光度计：测定波长范围为400～760 nm的可见光区；

(2)紫外分光光度计：测定波长范围为200～400nm的紫外光区；

(3)红外分光光度计：测定波长范围为大于760nm的红外光区；

(4)荧光分光光度计：用于扫描液相荧光标记物所发出的荧光光谱；

(5)原子吸收分光光度计：光源发出被测的特征光谱辐射，被经过原子化器后的样品蒸气中的待测元素基态原子所吸收，通过测定特征辐射被吸收的大小，来求出被测元素的含量。

2.分光光度计按自动化程度分类：可分为手动、半自动、自动分光光度计。

3.分光光度计按软件可分为：带扫描、不带扫描。

三.分光光度计常见的用途：

1.核酸的定量

核酸的高吸收峰的吸收波长260 nm。利用260nm的波长可以定量测量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA的浓度。

除了核酸浓度，分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度。如A260/A280的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是280nm。纯净的样品，比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。

A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。

A320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品，A320一般是0。

2.蛋白质的直接定量

这种方法是在280nm波长，直接测试蛋白。选择Warburg 公式，光度计可以直接显示出样品的浓度，或者是选择相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度。

3.细菌细胞密度

细菌培养过程中，需要采用分光光度计准确测定细菌细胞密度。

OD600是追踪液体培养物中微生物生长的标准方法。在600nm波长下，以未加菌液的培养液作为空白液，测量定量培养后的含菌培养液。

四.几种常见的分光光度计的用途的区别：

(1)可见分光光度计

用来测量待测物质对可见光(400～760nm)的吸光度并进行定量分析的仪器，称为可见分光光度计。可在600nm测定细菌细胞密度。

(2)紫外可见分光光度计

紫外可见光谱仪用来测量待测物质对可见光或紫外光(200～760nm)的吸光度并进行定量分析的仪器。可以测定核酸和蛋白的浓度，也可以测定细菌细胞密度。

紫外分光光度计又可分为单光束,假双光束,双光束。它们的用途又有区别。

单光束：适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性。

双光束：自动记录，快速全波段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。仪器复杂，价格较高。

假双光束也就是比例双光束，它的原理是由同一单色器发出的光被分成两束，一束直接到达检测器，另一束通过样品后到达另一个检测器。这种仪器的优点是可以监测光源变化带来的误差，但是并不能消除参比造成的影响。

(3)红外分光光度计

一般的红外光谱是指大于760nm的红外光谱，这是研究有机化合物常用的光谱区域，能分析各种状态(气、液、固)的试样。

红外光谱法的特点是：快速、样品量少(几微克-几毫克)，特征性强(各种物质有其特定的红外光谱图)、能分析各种状态(气、液、固)的试样以及不破坏样品。

(4)荧光分光光度计

荧光分光光度计是用于扫描液相荧光标记物所发出的荧光光谱的一种仪器。应用于科研、化工、医药、生化、环保以及临床检验、食品检验、教学实验等领域。

通过对这些参数的测定, 不但可以做一般的定量分析，而且还可以推断分子在各种环境下的构象变化，从而阐明分子结构与功能之间的关系。

(5)原子吸收分光光度计

该法主要适用样品中微量及痕量组分分析常规仪器之一。是材料分析及质量控制部门进行常量、微量金属(半金属)元素分析的有力工具。