PCR常见问题及解决方案

问题

可能原因

解决方法

无产物或产量低

模板浓度偏低或偏高

电泳检测模板浓度，调整模板用量

模板降解

重新制备；基因组DNA、cDNA应小量分装后低温保存

模板中含有抑制反应的杂质

纯化模板

引物浓度不足

调整引物浓度，特别是针对长片段PCR

引物存在二级结构

重新设计引物，避免二级结构；优化退火温度

引物降解

引物应高浓度小量分装，-20℃保存，避免反复冻融

Mg²⁺浓度偏低

适当提高Mg²⁺浓度，从1 mM到3 mM以0.5 mM间隔递增，针对不同模板和引物摸索佳Mg²⁺浓度

dNTP降解

-20℃保存，小量分装，避免反复冻融

酶纯度低，扩增效率差

选用高质量DNA聚合酶

酶量不足

适当增加酶量

用酶不当

针对模板、目标片段的特选择适当的酶(详见PCR产品选择指南)

缓冲液失效

更换缓冲液或使用预混PCR反应体系

模板变性不充分

适当延长变性时间；对高GC或复杂结构模板，提高起始变性温度至98℃

退火温度偏高

降低退火温度，应比引物Tm低至少5℃

延伸时间不足

增加延伸时间，特别是针对长片段PCR

循环数目不够

增加循环数

PCR管污染

质量可靠的PCR管通常不需灭菌，否则应先高温高压灭菌处理；用过的PCR管不可清洗后重复使用

PCR仪故障

检查程序和模块温度

其他

使用PCR增强剂

非特异产物过多

体系污染

设计对照实验寻找污染源，操作时应注意避免交叉污染

引物浓度过高

适当减少引物浓度

引物序列特异性差

重新设计引物

Mg²⁺浓度过高

降低Mg²⁺浓度，从1 mM到3 mM以0.5 mM间隔递增，针对不同模板和引物摸索佳Mg²⁺浓度

dNTP浓度过高

降低dNTP浓度

酶量过多

减少酶量，以0.5 U间隔递减

退火温度过低

提高退火温度

延伸时间过短

增加延伸时间，以1 min间隔递增

循环次数过多

减少循环次数

模板结构过于复杂或目标片段过长

特选择适当的酶(详见PCR产品选择指南)；使用PCR增强剂

其他

HotStart PCR

TouchDown PCR

巢式PCR

引物二聚体

引物3’末端存在互补序列

重新设计引物

引物浓度过高

降低引物浓度

模板浓度过低

提高模板浓度

退火温度不合适

优化退火温度

循环次数过多

减少循环次数

其他

HotStart PCR

拖尾严重

引物浓度过高

调整引物浓度

引物序列特异性差或模板上存在同源序列

重新设计引物

模板降解

重新制备模板

模板浓度过高

降低模板浓度

dNTP浓度过高

减少dNTP用量

Mg²⁺浓度过高

降低Mg²⁺浓度，从1 mM到3 mM以0.5 mM间隔递增，针对不同模板和引物摸索佳Mg²⁺浓度

酶量过多或质量差

减少酶量，以0.5 U间隔递减；更换质量可靠的酶

变性温度过低

提高变性温度，以0.5℃递增

退火温度过低

提高退火温度

延伸时间过长

缩短延伸时间

循环次数过多

减少循环次数，以2个循环间隔递减

体系污染

设计对照实验，消除污染源

其他

HotStart PCR

TouchDown PCR

巢式PCR

假阳性

目标片段与非特异扩增片段间存在同源性

设计阴性对照，确认为引物问题后重新设计引物

体系污染

设计阴性对照判断是否有污染，去除污染源